血浆蛋白结合是药物分子的基本药代属性，它会对我们在生物分析工作中的提取回收率(Extraction Recovery)造成影响。药物分子与蛋白质之间的作用力是提取回收率在本质上最重要的原因之一。药物加入到蛋白质体系中后，会与蛋白质之间形成各种形式的作用力，如范德华力、氢键、疏水作用力、共价键等，总体上可分为可逆的和不可逆的作用力。可逆性蛋白结合一般在5-10分钟内就可以达到相当程度的平衡；不可逆性结合则随时间的进行而一直发生。

在蛋白沉淀法(Plasma Protein Binding, PPT)和液液萃取法(Liquid-Liquid Extraction, LLE)中，加入的有机溶剂都会使蛋白质变性。如果药物分子与蛋白质之间是可逆性结合，蛋白质沉淀后两者之间的作用力就被破坏掉了，药物与蛋白质结合的基础不复存在，药物就被释放进溶剂，但在此过程中，总会有一部分药物被trap在蛋白质沉淀中；如果是共价结合（不可逆），蛋白质变性后也不会破坏这种共价键，蛋白质沉淀后会带着药物一起沉淀下去。因此，不管形成何种作用力，对蛋白质进行沉淀化处理时，总会有一部分药物在蛋白质沉淀的过程中不能释放到溶剂中（最后的上清），由此形成回收率的问题。

通常情况下，PPT和LLE都可以使绝大部分的蛋白质沉淀下去。因此，对于可逆性结合来讲，PPT和LLE大多可以达到理想的提取回收率（≧80%）；而且有机溶剂相对于样品体积的倍数越高（一般最少3-4倍），提取回收率亦越高。但需注意，在药物分子的极性非常大（如LogP≦0）的情况下，其可能在有机溶剂中的绝对溶解度很低（或有机相中溶解度相对于水相很低），从而造成较低的提取回收率。在这种情况下，LLE显然不适用，而换用极性更大的沉淀剂、降低沉淀剂倍数或采用酸沉淀的PPT则有可能适用。作者所领导的实验室（湖南恒兴医药科技有限公司）处理过一个例子：分析物为头孢地尼(Drugbank 网站中显示其实测LogP = -0.2)，用8倍体积比的乙腈进行蛋白沉淀时回收率仅为60%左右，而换用8倍体积比的甲醇或4倍体积比的乙腈则可以获得接近100%的回收率。

在固相萃取(Solid-Phase Extraction, SPE)中，血浆样品可不经过任何处理即可用于上样。然而在这种情况下，与血浆蛋白结合的药物分子因为其整体尺寸过大，无法进入到填料颗粒微孔中被保留而直接流出或被洗出，进而极大影响回收率（大家想想，绝大多数药物分子的血浆蛋白结合率高于50%）。因此，大部分情况下，在Load到SPE小柱之前，血浆样品仍需要进行简单处理如：调节pH至极端值使药物游离出来、加入强酸进行蛋白沉淀、对样品超声后加入水或缓冲溶液等。即便如此，对于血浆蛋白结合率高的药物分子来说，SPE的低回收率仍然是其经常面临的问题。

对于与血浆蛋白质不可逆性结合的药物分子（如具有迈克尔受体或游离巯基结构的分子）来说，其挑战不在于选择PPT、LLE或是SPE，而在于药物分子与蛋白质之间的结合是以一定的速率持续不断地进行的，而结合之后不管通过何种样品处理方式都无法被释放出来。所以这种情况也可以被认为是一种稳定性的问题，在我们的实际工作中会造成比较大的麻烦和隐患。比如，药物被加入到血浆并混匀后，在进行样品处理前所等待的时长不一样，就有可能造成实际回收率不一样，而出现标曲线性不良、测得回收率变异大、质控样品不合格、批次间信号差异大等问题。更严重的是，即便想办法控制了实验条件的一致性而使得标曲、质控等看上去合格了，却忽视了未知样品的浓度真实性。在作者本人的研究历史上，曾很多次与此类化合物（如阿法替尼及其me-too新药）进行“亲密接触”，感触颇深。

药物的血浆蛋白结合影响着分析过程中的提取回收方法，不可逆的结合甚至会给药物的浓度检测带来较大的麻烦，处理好这一问题在生物样品检测过程中是非常重要的。

后续我们还将讨论更多的议题，敬请期待。