【恒兴大讲堂】生物样品分析秘籍之三——血细胞内外分布对生物分析的影响
来源：恒兴医药 郭建军
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上一期我们讨论的是血浆蛋白结合对生物分析的影响，该议题得到了不少关注，还有一些同仁提出了相关的问题，这里就典型问题进行一下回答。
问：请教一下，什么情况下会是共价键结合？有实例否？
答：我在文中提到了两种典型情况，一种是具有Michael Acceptor（迈克尔受体，即alpha-beta 不饱和醛/酮结构）的分子，一种是具有游离巯基的的分子。前者如阿法替尼和国内某药厂的XX替尼，在某些物种的血浆和全血中具有这种现象，其在这些基质中放置一段时间后，会出现信号下降的情况；后者如卡托普利和氯吡格雷的活性代谢物AM，其游离巯基可以与蛋白质中的二硫键进行置换反应而结合在蛋白质上。当然，对于后一种情况，游离巯基除了可以共价结合在蛋白质上之外，还极容易氧化或者自身形成二硫键（即形成二聚体），共同导致其稳定性问题。
我也在文中提到了，共价键结合的情况其实本质上就是一种稳定性问题了。需要用稳定性的思维，结合分子本身的结构特性来考察和设计其处理和稳定条件，试图找到一种可以接受的稳定条件。比如可将化合物在第一时间就进行沉淀处理，或采用衍生化手段转变为另一种稳定的化合物来进行分析。
另外，对于我刚在上面讲到的具有迈克尔受体的分子，一般而言其在全血中的稳定性问题比其在血浆中的稳定性问题更严重。因为血红素中的卟啉环是富电子结构，而迈克尔受体是亲电子结构，两者天然就是互相对眼的。所以，针对这种结构，在全血稳定性考察环节，需要尤为注意。
以上为个人见解，还请大家多多指教。
好啦，接下来我们将探讨的是血细胞内外分布对生物分析的影响。欢迎大家以各种形式联系我们，共同探讨相关问题。
同血浆蛋白结合一样，药物分子在血细胞内外的分布也是其基本的药代属性。全血和血浆药物浓度之间的关系可以用以下公式描述：
Cb、Cp和Cr分别是全血、血浆和红细胞中药物浓度，Hct是红细胞容积比（红细胞和全血容积的比值，通常是0.4~0.5）。如果将Hct=0.5代入公式，可以得到Cb=0.5·Cr+0.5·Cp。在平衡状态下，全血/血浆浓度比值(Cb/Cp)和红细胞/血浆浓度比值(Cr/Cp)是一定的。对于大部分的药物分子来说，Cb/Cp在0.8-1.2范围内，相当于Cr/Cp在0.6-1.4范围内。
药物分子在血细胞内外分布特性会在我们的生物分析工作中对全血稳定性的考察造成影响。实践中，我们会先将药物加入到预热至37摄氏度的全血中混匀，并给予一定的时间（一般为5-15分钟）让药物分子在血细胞内外进行分布后分为两份，一份立刻进行处理作为T0对照，而另一份则在规定的条件下放置规定的时间（事先确定好的稳定性考察时长）后进行处理。至于处理的方式，按思路，目前各实验室的做法大致分为两种（见下图）：1）离心去除血细胞后分析血浆浓度；2）直接分析全血。
这两种方法各有优缺点，但总体上在GLP分析中采用第一种方法的更多。原因是可直接采用经过验证或待验证的血浆样本分析方法进行分析，结果更可靠。但这里有一点tricky的地方尤其需要各位同仁们注意，就是药物加入到全血中后给予其完成血细胞内外分布平衡的时间是否足够。想象一下：药物分子加入到全血中的一瞬间（或是加入后混匀后的一瞬间）其实仅仅分布到了血液的无形成分即血浆中，在其后的时间中一部分药物分子会逐渐迁移到血细胞中，最后达到血细胞内外的平衡（见下图）。这个过程以数学的方式描述为：在药物加入到全血中的瞬间，药物分子在全血中的浓度为100%、在血细胞中的浓度为0，则其在血浆中的浓度为200%；经过足够的分布时间后，药物分子在血细胞内外分布达到平衡，此时全血中的浓度仍然为100%、血细胞中的浓度变为Cr，而根据前述公式血浆中的浓度变为Cp=200%-Cr。问题是：如果给予的平衡时间不够的话，作为T0对照的全血离心出来的血浆浓度必然是高于200%-Cr的，最终得到的全血稳定性结果就一定是fake的，有可能会将本无稳定性问题的情况判定为有问题。
做过体外ADME研究的药代或生物分析的同仁应该都知道，有一个assay就是叫“全血/血浆浓度比值测定”或“血细胞/血浆浓度比值测定”，这个assay中的一个重要步骤就是在全血中予以常规1小时的分布平衡时间。当然，体外assay中是为了保证血细胞内外分布的绝对平衡，而我们在生物分析中给予的平衡时间确实也不需要这么长，合适就可以了。但是否合适，最好在方法开发中予以一定的考察，以便为最后的验证条件提供科学化的支持。作者所领导的实验室（湖南恒兴医药科技有限公司）处理过一个例子：分析物为布洛芬，方法开发过程中考察了5、15、30分钟的分布平衡时间，最后发现在5分钟的平衡时间后得到了全血不稳定的假性结果，而15、30分钟的结果则是完好的。也需要提醒一下各位，在孵育过程中（而不仅仅是在时间节点上）一定要给予充分的颠倒混匀。因为血细胞是会沉降的（正常人血红细胞的沉降速率是0-20 mm/h），会降低血浆中的药物向血细胞中迁移的效率。
前面我们讨论的是药物在血细胞内外的分布比较均衡的情况，但万一药物分子在血细胞中的浓度远大于血浆呢。个人意见是，这种情况下最好采用直接测定全血浓度的方式来考察全血稳定性。因为仍采用第一种方式的话，可能会造成实验重复性差、平行样品间的变异大等问题，毕竟这种方式是“将一小撮分子与人民大众划等号嘛”，呵呵。其实，针对这样的药物，一般在PK/BE研究中也建议直接测定全血以反映更真实的情况（这样的话，针对全血也就有了经过验证的分析方法了）。举几个例子，环孢素A的血细胞：血浆浓度=2：1（算比较大了），其FDA的BE指导原则建议可测血浆或全血浓度；但对于该比值更大的药物如依维莫司（血细胞：血浆浓度>5：1）、他克莫司（血细胞：血浆浓度=20：1）、西罗莫司（血细胞：血浆浓度=36：1），FDA的BE指导原则都是建议直接测定全血浓度。
后续我们还有更多的精彩议题，敬请期待。
▷药物结构对其质谱响应的影响
▷药物代谢产物对分析物的干扰
▷药物结构对稳定性的影响
▷药物体内Cmax及半衰期
▷...........
